1.シングルセル調製
シングルセル(1細胞)解析を行うためにはまずシングルセルの細胞懸濁液を調整する必要があります。下記の様な技術・手法がありますが、培養細胞以外の組織化している細胞集団から調整する際は物理的ホモジナイズ処理やコラーゲン分解酵素処理などを最初に実施した後に各方式によって処理する必要があります。

・メッシュ/フィルター方式
メッシュやフィルター上で直接物理的に組織を断片化したり、穴径によってサイズ選定や凝集塊の除去などを行えます。

・ピッペット/マイクロマニュピレーター方式
顕微鏡下でピペットやマイクロマニュピレーターを操作しながら取り分ける方法です。マニュアル操作なので少数のサンプルを得る場合に有効で、人のスキルに依存します。直接ウェルプレートにシングルセルごとに取り分けることによって他の単離操作を行うことなくシングルセルアッセイを行うこともできます。

・ソーター方式
ソーターを使用することで高いスループットで特異的な細胞を選別した細胞懸濁液を調整することが可能になります。例えば、7-AAD(0.25µg/mL)、PI(1 µg/mL)、DAPI(100 ng/mL)等を用いて死細胞を生細胞集団より除去できます。シーケンスにて無駄なコストを発生させない為にも死細胞を除いておくことがとても重要になってきます。分注機能がソーターに付加されている装置の場合は直接ウェルプレートにシングルセルを分注することによって他の単離操作を行うことなくシングルセルアッセイを行うこともできます。

・レーザー方式
レーザー照射によって組織や培養集団より必要な細胞のみを取り出す方法があります。スループットが懸念点になりますが、近年は、AIとの組み合わせによって高速で記憶させた細胞を認識したり、不要な細胞を自動的に破壊したりする技術も出てきています。

 

細胞懸濁液のカウント及び再調製
それぞれのプラットフォームなどで必要な細胞濃度は変わってきますが、下記リンク先の10x Genomicsのフローチャートが分かりやすいです。各装置でシングルセル単離する前に下記のような最終調製工程を入れることをお勧めいたします。
Guidelines for Optimal Sample Preparation(10x Genomics)

 

2.シングルセル単離