シングルセル解析

シングルセル（1細胞）を、ドロップレットやウェルなどの微小区画に分配し、個別バーコード（識別）配列を有するmRNA捕捉粒子と1細胞ずつペアリングして単離します。

ドロップレット方式では、これらの微小区画はドロップレットジェネレーターによって生成され、細胞懸濁液とmRNA捕捉粒子が制御された流体条件下で効率よく封入されます。

この区画化の過程では、1つの区画内に2個以上の細胞が同時に入る確率（ダブレット率）が重要な指標となります。ダブレットが発生すると、複数細胞由来の遺伝子発現情報が同一細胞のデータとして混在して検出されるため、細胞集団の誤分類や解析結果の解釈に影響を与える可能性があります。

そのため、シングルセル解析プラットフォームを選定する際には、ダブレット率を性能評価の重要な指標として比較することが不可欠です。また、投入する細胞数が増加すると統計的にダブレット率も上昇するため、異なるプラットフォームを比較する際には同一投入細胞数条件でのダブレット率を確認することが重要です。

細胞の単離時には、細胞溶解液とmRNA捕捉粒子をあらかじめ同一溶液として用意し、ドロップレット生成の過程で細胞とともに封入します。これにより、細胞はドロップレット内で初めて細胞溶解液およびmRNA捕捉粒子と接触し、区画形成と同時に細胞溶解およびmRNA捕捉が開始されます。

この設計により、細胞単離後の操作を最小限に抑えつつ、細胞間の混入を防ぎながら、再現性の高いシングルセル遺伝子発現解析を実現します。

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逆転写・cDNA合成

バーコード（識別）配列を持ったビーズやハイドロゲルなどのmRNA捕捉粒子によって捕捉されたmRNAは、ドロップレットやウェルから回収されます。これらのmRNAには、どの細胞由来であるかを示す細胞バーコードや、個々のmRNA分子を区別するためのユニーク分子識別子（UMI）が付加されています。

回収されたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いた逆転写反応を行うことで、mRNA配列に対応するcDNA（相補的DNA）の第1鎖が合成されます。この際、mRNAに付加されていたバーコード配列やUMI情報も同時にcDNAへと引き継がれるため、後の解析において、どの細胞からどの遺伝子が発現していたかを識別することが可能になります。

この逆転写／cDNA合成工程は、RNAという不安定な分子情報を、安定で増幅可能なDNA情報へ変換する重要なステップであり、以降のライブラリー調製や次世代シーケンシング解析の基盤となります。

NGS（次世代シーケンシング）

ライブラリー調製されたDNAを用いて、Illumina社などの次世代シーケンサーによる配列解析を行います。シングルセルRNA解析では、主にNextSeq 1000／2000やNovaSeq Xシリーズなどのプラットフォームが用いられ、解析規模や目的に応じて機種を選択します。

シーケンシングによって得られたリード配列には、細胞バーコードおよびUMI情報が含まれており、これらをもとに 細胞ごとの遺伝子発現情報を高精度に再構築することが可能です。NGS工程は最終的なデータ品質を左右する重要なステップであり、目的に応じた適切なプラットフォーム選択が求められます。

データ解析

シングルセル解析では、NGSによって得られたシーケンスデータに対して、複数の解析ステップを段階的に実行します。
まず、Cell Ranger などの一次解析ソフトを用いて、リード配列のトリミング、参照ゲノムへのマッピング、細胞バーコードおよびUMI情報に基づく発現量の定量を行い、細胞×遺伝子の発現行列を作成します。

得られた発現データは、Seurat（R）やScanpy（Python）といった二次解析ソフトを用いて解析されます。これらのツールでは、品質管理（QC）、正規化、バッチ効果補正などを行い、細胞間の技術的ばらつきを低減します。

その後、次元削減（PCA、UMAPなど）やクラスタリング解析を行うことで、遺伝子発現パターンが類似した細胞群を同定します。最終的に、マーカー遺伝子の発現解析や可視化を通じて、細胞タイプの推定や状態変化の解析など、生物学的な解釈につなげていきます。

データ解析結果の例（UMAP図・t-SNE図・クラスタリング）

データ解析の結果は、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）やt-SNE（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding）などの次元削減手法を用いて可視化されることが一般的です。これらの図では、各点が1細胞を表し、遺伝子発現パターンが類似した細胞同士は近くに配置されます。

UMAPは、全体構造と局所構造のバランスを保ちつつ可視化でき、再現性や大規模データへの適用性に優れるため、近年のシングルセル解析で広く用いられています。
一方、t-SNEは局所的な類似性の強調に優れており、近い細胞同士の関係性を直感的に把握するのに適しています（全体構造の解釈には注意が必要です）。

これらの可視化上で形成される集団（クラスタ）は、共通した遺伝子発現特徴を持つ細胞群を示します。クラスタごとにマーカー遺伝子の発現を確認することで、細胞タイプや細胞状態の推定を行うことができます。このような解析結果を通じて、条件依存的な変化や新規細胞サブタイプの発見につなげることが可能です。

シングルセルRNA-seq解析及びシングルセルレパトア解析の受託サービス

受託サービスは下記にて提供されております。

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• KOTAIバイオテクノロジーズ株式会社（外部ページへ）
• 大阪大学微生物病研究所 遺伝情報実験センター（外部ページへ）